Elektrofores av grön hushållsfärg

[<-- Tillbaka till experimentet] [Kemisk bakgrund] [Fördjupning]

Kemisk bakgrund

Så fungerar elektrofores

Elektrofores kan beskrivas som en vandring av laddade molekyler eller partiklar i en vätska eller gel under inverkan av ett elektriskt fält. Vid anoden (positiv pol) sker en oxidation (e⁻ avges) och vid katoden (negativ pol) sker en reduktion (e⁻ tas upp). Vilka ämnen som reduceras och oxideras beror på vilka ämnen som finns med i elektroforesen, men vad som alltid sker är en sönderdelning av vatten.

Anod (+ pol)	+ → ← −	Katod (− pol)
2 H₂O → O₂(g) + 4 H⁺ + 4 e⁻		4 H₂O + 4 e⁻ → 2 H₂(g) + 4 OH⁻

Positivt laddade ämnen går mot katoden och negativt laddade mot anoden för att jämna ut den skillnad i laddning som uppkommer vid respektive pol. Salt måste tillsättas för att ett elektriskt fält ska bildas och det är viktigt att välja en lämplig jonstyrka. Vanligt är att använda sig av en jonstyrka mellan 0,05 - 0,10 molar (5), men ofta får man prova sig fram. Låg jonstyrka ger en snabbare separation men diffusa band. Med en högre jonstyrka får man en tydligare separation, men nackdelen är att det tar längre tid och vi får en högre värmeutveckling. En effektiv kylning motverkar diffusion och negativ påverkan på det som analyseras (proteiner kan denatureras om värmen blir för hög). För att bibehålla samma pH i hela gelen trots att det bildas sura ämnen vid anoden och basiska vid katoden, är det också bra om det salt man tillsätter är buffrande. Många ämnens laddning är också pH-beroende och kan ändras om pH i gelen förändras.

Historik om elektrofores

Ursprungligen utfördes elektrofores i lösning. En något senare variant var att använda ett fuktat papper vars olika ändar låg i separata byttor där man anslöt anoden och katoden. Betydligt effektivare separationer fick man när man började använda sig av olika typer av geler. Arne Tiselius, svensk kemist och professor i biokemi vid Uppsala Universitet, utvecklade elektroforestekniken och visade, bl.a. med hjälp av elektrofores på stärkelsegel (potatismjöl), för första gången att människans serum innehåller minst fyra olika proteingrupper. Tiselius fick nobelpriset i kemi 1948 (6). Än idag analyserar man proteiner i plasma och urin på liknande sätt. Se figur 3. Det karakteristiska mönstret vid elektrofores förändras vid flera olika sjukdomar och man kan snabbt få en uppfattning om möjliga diagnoser och vilka ytterligare analyser och undersökningar som kan vara relevanta (7).

Figur 3 Typiskt mönster av proteiner vid elektrofores av blodplasma.

Gelens nätverk separerar molekyler efter storlek

Stärkelsegel

Många molekyler har samma laddning och för att ytterligare separera ämnen använder man sig av olika egenskaper i gelen. Stärkelse (potatismjöl) värms under omrörning varvid det sker en hydrolys och kolhydratkedjorna (amylos och amylopektin) binds ihop till ett nätverk. Genom att låta de ämnen man vill separera vandra i en detta nätverk får vi ytterligare en faktor som skiljer dem åt. Stora molekyler bromsas upp i nätmaskorna medan små lättare slinker igenom. Stärkelsegel ger en mycket bra upplösning, dvs ämnen nära i storlek och med samma laddning kan separeras, men stärkelsegel har fått mindre betydelse idag eftersom det är en naturlig produkt och därför inte alltid helt igenom homogen. Halten amylos/amylopektin kan skilja sig åt och ger då inte exakt samma "nät" och resultat från gång till gång.

Agarosgel

Geler uppbyggda av den naturligt förkommande polysackariden agar användes tidigt. En variant av den kallas för agaros och har fått ett uppsving igen med nya molekylärbiologiska metoder (se nedan). Den ger en mycket porös gel med stora hålrum som lämpar sig väl för separation av stora molekyler eller där man enbart vill ha en separation som bygger på skillnader i laddning. Elektrofores av plasmaproteiner sker rutinmässigt inom sjukvården på agarosgel, se bild 3.

Polyakrylamidgel

PAG, polyakrylamidgel är den vanligaste gelen idag. Det är en syntetisk produkt och därför är gelens porstorlek lätt att kontrollera. Gelen byggs upp av akrylamid och av N,N'-metylen-bis-akrylamid (crosslinking agent). Förhållandet mellan dessa två ämnen avgör gelens porstorlek. Om man ökar halten bis-akrylamid som korsbinder akrylamiden, minskar porstorleken. För att starta polymeriseringen tillsätts TEMED (tetrametyletylen diamin) och ammoniumpersulfat som fungerar som katalysatorer (8).

Figur 4 Akrylamid, metylen-bis-akrylamid och del av polyakrylamidkedja.

Bild: © Svante Åberg

Akrylamid är giftigt och ska handhas med största försiktighet. När väl gelen är gjuten och polymeriseringen klar är produkten ofarlig. Det blir därför allt vanligare att man för standardanalyser köper färdiga geler, som kan beställas med olika porstorlekar för separation av ämnen inom olika molekylviktsområden.

SDS-PAGE

SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulphate polyakrylamid elektrofores är en viktig teknik för molekylviktsbestämning av proteiner. Man börjar med att bryta eventuella S-S-bryggor i sitt protein med merkaptoetanol och veckla ut den tredimensionella strukturen genom uppvärmning så att proteinet blir en lång rak kedja av aminosyror. Sedan tillsätter man SDS till sitt prov. SDS (natriumdodecylsulfat) är en surfaktant (ytaktivt ämne) som binder till proteinkedjorna. SDS är kraftigt negativt laddat och maskerar proteinets egen laddning. Det gör att proteinets rörligheten i det elektriska fältet är konstant med avseende på massa. Gelens porstorlek och sileffekt är däremot omvänt proportionell mot proteinets storlek. Små proteiner slinker lätt igenom medan stora bromsas upp och vi får en separation enbart beroende av storlek. Bredvid sina prover sätter man en standardlösning av proteiner med kända molekylvikter för att jämföra med de okända proverna.

Figur 5 Schematisk bild av utrustning för körning av SDS-PAGE med exempel på hur en gel för molekylviktsbestämning kan se ut. Här finns två okända prover och längst till vänster en molekylviktsstandard. Observera att banden i gelen är osynliga under elektroforesen, men infärgas senare.

Bild: © Svante Åberg

Isoelektrisk fokusering

Vid isoelektrisk fokusering bygger man upp en pH-gradient i sin gel istället för att försöka hålla konstant pH. Det används för att separera proteiner. Proteiner är amfolyter dvs. de kan både vara positivt och negativt laddade beroende på omgivningens pH. Protein som är uppbyggda av långa kedjor av aminosyror har en karboxylgrupp (minusladdad eller neutral ) i en ända och i den andra änden en aminogrupp (positivt laddad eller neutral). Dessutom finns det aminosyror med laddade sidokedjor, exempelvis histidin och aspargin.

Figur 6 Aminosyran har både en sur och en basisk funktionell grupp.
Aminosyror bildar peptidbindningar.

Bild: © Svante Åberg

Vid ett visst pH tar olika laddningar hos aminosyrorna ut varandra och proteinet blir oladdat vilket motsvarar proteinets isoelektriska punkt. Om proteiner vandrar i ett elektriskt fält i en gel som innehåller en pH-gradient kommer de att förflytta sig till dess att de når sin isoelektriska punkt. Eftersom de där är elektrisk neutrala kommer de att stanna där. För att i en gel bygga upp en pH-gradient använder man sig av ampholinR. Det är polyamino-polykarboxylsyror som leder ström trots att de uppnått sin isoelektriska punkt (8). Man tillsätter en blandning av ampholiner, med olika isoelektrisk punkt, i sin gel. När spänning läggs på vandrar de till sin isoelektriska punkt, stannar där och bygger upp pH-gradienten. Provet tillsätts och vandrar till den punkt där det når sin isoelektriska punkt och blir neutralt.

Bioteknik

Elektrofores har stor betydelse för de idag så viktiga metoderna inom bioteknik som kallas Southern, Northern och Western blotting. Southern blotting är en metod för att identifiera specifika DNA-sekvenser. DNA bryts ner till mindre fragment av enzymer för att sedan separeras i en gel. Här används oftast agarosgel. DNA-fragmenten är stora och vid neutrala pH är fosfatgrupperna i DNA-molekylen negativt laddade. Om man vill separera mycket små DNA-fragment använder man en polyakrylamidgel. DNA:et i gelen förs efter separation över till ett membran (blotting) för vidare analys. "Blotting" innebär att man först lägger ett membran (ofta av nitrocellulosa) på gelen, ovanpå lägger man lager av absorberande papper och sedan en tyngd. Fukten i gelen sugs ut och DNA:et följer med och binds till membranet.

Figur 7 Schematisk bild av hur en "blotting" går till.

När DNA-fragmenten finns på membranet kan det identifieras med olika tekniker. Ett sätt är att tillsätta en radioaktivt inmärkt DNA-sekvens som man är intresserad av till membranet. Den kommer bara att binda om den hittar en komplementär kedja av DNA (8).

På liknande sätt kan man separera och identifiera mRNA (Northern blotting) och proteiner (Western blotting). Tekniken för att identifiera DNA utvecklades först av en brittisk molekylärbiolog E. M. Southern som fick ge namn åt metoden (6). När motsvarande tekniker utvecklades för RNA och proteiner fick de från början skämtsamt motsvarande namn, men samtliga är nu accepterade begrepp inom bioteknik.

Kapillärelektrofores

Kapillärelektrofores är ett samlingsnamn för flera olika tekniker, som började användas i slutet av 1980-talet (8). Det gemensamma för dem är att elektroforesen sker i ett smalt rör, en kapillär, som är mindre än 0,1 mm i diameter. Röret kan vara mellan 1 dm och upp till en meter långt. Typiskt är också att man använder mycket hög spänning (30 000 V). Vid "vanlig" elektrofores rör det sig om 100-200 V. Trots den höga spänningen är inte värme ett problem eftersom det smala röret ger en stor yta så värmen avleds enkelt. Kapillären doppas i provet och monteras i instrumentet.

Figur 8 Schematisk bild av hur ett instrument för kapillärelektrofores kan vara uppbyggt.

De olika molekylerna i provet separeras och analys av banden sker oftast redan i kapillären när de passerar en detektor. Detektorn registrerar ofta bandets absorbans men andra typer av detektion är också möjlig, fluorescens, refraktionsindex m.fl. Det förekommer också att de separerade proverna från kapillären leds direkt in i en masspektrometer för analys. Det finns ett antal varianter på kapillärelektrofores som alla bygger på tidigare utvecklade tekniker. Några exempel är kapillärzonelektrofores, separationen i kapillärröret sker i en buffertlösning och kapillärgelelektrofores, röret är fyllt med en gel.

Fördelarna med kapillärelektrofores är att upplösningen är mycket hög. Molekyler med liknande egenskaper kommer ut som separata band och tekniken kan anpassas för många olika ämnen. Man behöver mycket små provvolymer och analysen går fort.

Färgämnen

Patentblått E131 och kinolingult E104 är två livsmedelsfärger som ingår i grön hushållsfärg (1,3,4). Färgämnena patentblått innehåller en och kinolingult två Na⁺ som avges när ämnet löser sig. Kinolingult får nettoladdningen -2 och patentblått -1. Båda rör sig därför mot anoden, men kinolingult rör sig snabbare med två negativa laddningar. Kinolingult är dessutom något mindre i storlek och rör sig därför också fortare i det täta nätverk som en stärkelsegel bildar.

Figur 9 a) Patentblått E 131, b) Kinolingult E104.

Färgämnena patentblått innehåller en och kinolingult två Na⁺ som avges när ämnet löser sig. Kinolingult får nettoladdningen -2 och patentblått -1. Bägge rör sig därför mot anoden, men kinolingult rör sig snabbare med två negativa laddningar. Kinolingult är därtill något mindre i storlek och rör sig därför också fortare i det täta nätverk som en stärkelsegel bildar.