Elektrofores av grön hushållsfärg

Tillhör kategori: elektrokemi, redox, kemiska metoder

Författare: Gun Celander

Introduktion Riktlinjer Säkerhet Materiel Förarbete Utförande Förklaring Kemisk bakgrund Fördjupning Litteratur Fler experiment

Tid för förberedelse: 10 minuter

Tid för genomförande: 60 minuter

Antal tillfällen: 1

Säkerhetsfaktor: Utföres med normal varsamhet

Svårighetsgrad: Kräver viss labvana

Introduktion

I det här experimentet ska vi separera färgerna i grön karamellfärg. Vi ska göra en gel av potatismjöl och sedan leda elektrisk ström genom den. Om färgerna som ingår i grön karamellfärg har olika laddning kommer de att uppträda olika i det elektriska fält som bildas.

Riktlinjer

Experimentet kan utföras individuellt. Om man arbetar med elever på högstadiet bör kanske elektroforesen genomföras gemensamt om man använder en likströmskälla. Har man tillgång till en likströmskälla passar även experimentet att genomföras som en demonstration. Eventuellt kan man lägga gelen på en overhead.

Säkerhet

Alla kemikalier som används är ofarliga.

Försiktighet bör iakttas vid elektroforesen, det blir varmt och är strömförande! Om man använder sig av en likströmskälla måste man vara extra försiktig eftersom spänningen kan vara hög.

Avfall kan slängas i papperskorg och spolas ut vasken.

Materiel

Förarbete

Blanda buffertlösning.

Eventuellt kan man göra i ordning gelerna i förväg om man vill minska på tiden för själva experimentet med 20-30 minuter.

Utförande

  1. Gjut gelen.
    • Blanda 2 teskedar potatismjöl med 50 ml vatten och 10 ml buffert.
    • Värm blandningen försiktigt under omrörning till dess att den tjocknar. Det får inte koka!
    • Häll försiktigt eller bred ut gelen på objektsglaset. Låt stelna. (Förvara objektsglasen fuktigt om de inte ska användas genast.)
  2. Doppa bakdelen av en tändsticka i den gröna karamellfärgen och drag ett lodrätt streck på mitten av objektsglaset ner i den mjuka gelen.
  3. Nyp fast krokodilklämmorna, med kablar på varsin sida av objektsglaset och lägg glaset på ett urglas fyllt med is. Se till att glaset ligger stadigt och väl synligt. Från och med nu får man inte röra objektsglaset!
  4. Anslut kablarna till ett spänningsaggregat (eller ett batteri). Starta elektroforesen. Ställ in spänningen på 20 V. Var uppmärksam på om det blir för varmt. Låt elektrolysen gå ungefär en kvart. Då ser man två tydliga band, ett blått och ett gult. Det gula bandet har vandrat längre från mittlinjen där provet applicerades. Om man använder sig av 9 V batterier tar det betydligt längre tid, uppemot 40 minuter. Det går att seriekoppla flera batterier.
  5. Stäng av spänningsaggregatet och koppla ur kablarna.
Figur 1 Objektglas med krokodilklämmor fungerar som uppställning för gelelektroforesen
Bild: © Svante Åberg

Variation

Experimentet kan varieras genom att man undersöker andra färgade ämnen. Se exempel på livsmedelsfärger i experimentet Färgämnen i M&M: E104 (gul), E110 (orange), E122 (röd), E124 (röd), E129 (röd) och E133 (blå).

En annan variant är att ändra gelen och ser hur det påverkar elektroforesen. Byt buffert mot vatten, ändra till extrema pH, låt gelen innehålla mer eller mindre mängd potatismjöl osv.

En enklare variant är att prova utföra elektroforesen i en petriskål med buffert istället för en gel. Som elektroder kan man använda grova blyertsstift (2).

Förklaring

Vid elektrofores vandrar laddade ämnen i ett elektriskt fält. Positivt laddade ämnen går mot katoden (negativ pol) och negativt laddade mot anoden (positiv pol). Ju mera laddad molekylen är desto fortare rör den sig. Gelen bidrar också till separationen genom att bromsa upp stora molekylers vandring mera än små som rör sig mera obehindrat i det nätverk som gelen utgör.

Grön karamellfärg innehåller två livsmedelsfärger, patentblått respektive kinolingult (4). Kinolingult får i vattenlösning två negativa laddningar och rör sig därmed fortare mot anoden (pluspolen) än vad patentblått gör som har en negativ laddning och är något större.

Figur 2 Färgen separerar därför att den gula färgen vandrar snabbare än den blå.
Bild: © Svante Åberg

Kemisk bakgrund

Vy för utskrift av kemisk bakgrund och fördjupning

Så fungerar elektrofores

Elektrofores kan beskrivas som en vandring av laddade molekyler eller partiklar i en vätska eller gel under inverkan av ett elektriskt fält. Vid anoden (positiv pol) sker en oxidation (e avges) och vid katoden (negativ pol) sker en reduktion (e tas upp). Vilka ämnen som reduceras och oxideras beror på vilka ämnen som finns med i elektroforesen, men vad som alltid sker är en sönderdelning av vatten.

Anod (+ pol) +
Katod (− pol)
2 H2O → O2(g) + 4 H+ + 4 e   4 H2O + 4 e → 2 H2(g) + 4 OH

Positivt laddade ämnen går mot katoden och negativt laddade mot anoden för att jämna ut den skillnad i laddning som uppkommer vid respektive pol. Salt måste tillsättas för att ett elektriskt fält ska bildas och det är viktigt att välja en lämplig jonstyrka. Vanligt är att använda sig av en jonstyrka mellan 0,05 - 0,10 molar (5), men ofta får man prova sig fram. Låg jonstyrka ger en snabbare separation men diffusa band. Med en högre jonstyrka får man en tydligare separation, men nackdelen är att det tar längre tid och vi får en högre värmeutveckling. En effektiv kylning motverkar diffusion och negativ påverkan på det som analyseras (proteiner kan denatureras om värmen blir för hög). För att bibehålla samma pH i hela gelen trots att det bildas sura ämnen vid anoden och basiska vid katoden, är det också bra om det salt man tillsätter är buffrande. Många ämnens laddning är också pH-beroende och kan ändras om pH i gelen förändras.

Historik om elektrofores

Ursprungligen utfördes elektrofores i lösning. En något senare variant var att använda ett fuktat papper vars olika ändar låg i separata byttor där man anslöt anoden och katoden. Betydligt effektivare separationer fick man när man började använda sig av olika typer av geler. Arne Tiselius, svensk kemist och professor i biokemi vid Uppsala Universitet, utvecklade elektroforestekniken och visade, bl.a. med hjälp av elektrofores på stärkelsegel (potatismjöl), för första gången att människans serum innehåller minst fyra olika proteingrupper. Tiselius fick nobelpriset i kemi 1948 (6). Än idag analyserar man proteiner i plasma och urin på liknande sätt. Se figur 3. Det karakteristiska mönstret vid elektrofores förändras vid flera olika sjukdomar och man kan snabbt få en uppfattning om möjliga diagnoser och vilka ytterligare analyser och undersökningar som kan vara relevanta (7).

Figur 3 Typiskt mönster av proteiner vid elektrofores av blodplasma.

Gelens nätverk separerar molekyler efter storlek

Stärkelsegel

Många molekyler har samma laddning och för att ytterligare separera ämnen använder man sig av olika egenskaper i gelen. Stärkelse (potatismjöl) värms under omrörning varvid det sker en hydrolys och kolhydratkedjorna (amylos och amylopektin) binds ihop till ett nätverk. Genom att låta de ämnen man vill separera vandra i en detta nätverk får vi ytterligare en faktor som skiljer dem åt. Stora molekyler bromsas upp i nätmaskorna medan små lättare slinker igenom. Stärkelsegel ger en mycket bra upplösning, dvs ämnen nära i storlek och med samma laddning kan separeras, men stärkelsegel har fått mindre betydelse idag eftersom det är en naturlig produkt och därför inte alltid helt igenom homogen. Halten amylos/amylopektin kan skilja sig åt och ger då inte exakt samma "nät" och resultat från gång till gång.

Agarosgel

Geler uppbyggda av den naturligt förkommande polysackariden agar användes tidigt. En variant av den kallas för agaros och har fått ett uppsving igen med nya molekylärbiologiska metoder (se nedan). Den ger en mycket porös gel med stora hålrum som lämpar sig väl för separation av stora molekyler eller där man enbart vill ha en separation som bygger på skillnader i laddning. Elektrofores av plasmaproteiner sker rutinmässigt inom sjukvården på agarosgel, se bild 3.

Polyakrylamidgel

PAG, polyakrylamidgel är den vanligaste gelen idag. Det är en syntetisk produkt och därför är gelens porstorlek lätt att kontrollera. Gelen byggs upp av akrylamid och av N,N'-metylen-bis-akrylamid (crosslinking agent). Förhållandet mellan dessa två ämnen avgör gelens porstorlek. Om man ökar halten bis-akrylamid som korsbinder akrylamiden, minskar porstorleken. För att starta polymeriseringen tillsätts TEMED (tetrametyletylen diamin) och ammoniumpersulfat som fungerar som katalysatorer (8).

Figur 4 Akrylamid, metylen-bis-akrylamid och del av polyakrylamidkedja.
Bild: © Svante Åberg

Akrylamid är giftigt och ska handhas med största försiktighet. När väl gelen är gjuten och polymeriseringen klar är produkten ofarlig. Det blir därför allt vanligare att man för standardanalyser köper färdiga geler, som kan beställas med olika porstorlekar för separation av ämnen inom olika molekylviktsområden.

SDS-PAGE

SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulphate polyakrylamid elektrofores är en viktig teknik för molekylviktsbestämning av proteiner. Man börjar med att bryta eventuella S-S-bryggor i sitt protein med merkaptoetanol och veckla ut den tredimensionella strukturen genom uppvärmning så att proteinet blir en lång rak kedja av aminosyror. Sedan tillsätter man SDS till sitt prov. SDS (natriumdodecylsulfat) är en surfaktant (ytaktivt ämne) som binder till proteinkedjorna. SDS är kraftigt negativt laddat och maskerar proteinets egen laddning. Det gör att proteinets rörligheten i det elektriska fältet är konstant med avseende på massa. Gelens porstorlek och sileffekt är däremot omvänt proportionell mot proteinets storlek. Små proteiner slinker lätt igenom medan stora bromsas upp och vi får en separation enbart beroende av storlek. Bredvid sina prover sätter man en standardlösning av proteiner med kända molekylvikter för att jämföra med de okända proverna.

Figur 5 Schematisk bild av utrustning för körning av SDS-PAGE med exempel på hur en gel för molekylviktsbestämning kan se ut. Här finns två okända prover och längst till vänster en molekylviktsstandard. Observera att banden i gelen är osynliga under elektroforesen, men infärgas senare.
Bild: © Svante Åberg

Isoelektrisk fokusering

Vid isoelektrisk fokusering bygger man upp en pH-gradient i sin gel istället för att försöka hålla konstant pH. Det används för att separera proteiner. Proteiner är amfolyter dvs. de kan både vara positivt och negativt laddade beroende på omgivningens pH. Protein som är uppbyggda av långa kedjor av aminosyror har en karboxylgrupp (minusladdad eller neutral ) i en ända och i den andra änden en aminogrupp (positivt laddad eller neutral). Dessutom finns det aminosyror med laddade sidokedjor, exempelvis histidin och aspargin.

Figur 6 Aminosyran har både en sur och en basisk funktionell grupp.
Aminosyror bildar peptidbindningar.
Bild: © Svante Åberg

Vid ett visst pH tar olika laddningar hos aminosyrorna ut varandra och proteinet blir oladdat vilket motsvarar proteinets isoelektriska punkt. Om proteiner vandrar i ett elektriskt fält i en gel som innehåller en pH-gradient kommer de att förflytta sig till dess att de når sin isoelektriska punkt. Eftersom de där är elektrisk neutrala kommer de att stanna där. För att i en gel bygga upp en pH-gradient använder man sig av ampholinR. Det är polyamino-polykarboxylsyror som leder ström trots att de uppnått sin isoelektriska punkt (8). Man tillsätter en blandning av ampholiner, med olika isoelektrisk punkt, i sin gel. När spänning läggs på vandrar de till sin isoelektriska punkt, stannar där och bygger upp pH-gradienten. Provet tillsätts och vandrar till den punkt där det når sin isoelektriska punkt och blir neutralt.

Bioteknik

Elektrofores har stor betydelse för de idag så viktiga metoderna inom bioteknik som kallas Southern, Northern och Western blotting. Southern blotting är en metod för att identifiera specifika DNA-sekvenser. DNA bryts ner till mindre fragment av enzymer för att sedan separeras i en gel. Här används oftast agarosgel. DNA-fragmenten är stora och vid neutrala pH är fosfatgrupperna i DNA-molekylen negativt laddade. Om man vill separera mycket små DNA-fragment använder man en polyakrylamidgel. DNA:et i gelen förs efter separation över till ett membran (blotting) för vidare analys. "Blotting" innebär att man först lägger ett membran (ofta av nitrocellulosa) på gelen, ovanpå lägger man lager av absorberande papper och sedan en tyngd. Fukten i gelen sugs ut och DNA:et följer med och binds till membranet.

Figur 7 Schematisk bild av hur en "blotting" går till.
Bild: © Svante Åberg

När DNA-fragmenten finns på membranet kan det identifieras med olika tekniker. Ett sätt är att tillsätta en radioaktivt inmärkt DNA-sekvens som man är intresserad av till membranet. Den kommer bara att binda om den hittar en komplementär kedja av DNA (8).

På liknande sätt kan man separera och identifiera mRNA (Northern blotting) och proteiner (Western blotting). Tekniken för att identifiera DNA utvecklades först av en brittisk molekylärbiolog E. M. Southern som fick ge namn åt metoden (6). När motsvarande tekniker utvecklades för RNA och proteiner fick de från början skämtsamt motsvarande namn, men samtliga är nu accepterade begrepp inom bioteknik.

Kapillärelektrofores

Kapillärelektrofores är ett samlingsnamn för flera olika tekniker, som började användas i slutet av 1980-talet (8). Det gemensamma för dem är att elektroforesen sker i ett smalt rör, en kapillär, som är mindre än 0,1 mm i diameter. Röret kan vara mellan 1 dm och upp till en meter långt. Typiskt är också att man använder mycket hög spänning (30 000 V). Vid "vanlig" elektrofores rör det sig om 100-200 V. Trots den höga spänningen är inte värme ett problem eftersom det smala röret ger en stor yta så värmen avleds enkelt. Kapillären doppas i provet och monteras i instrumentet.

Figur 8 Schematisk bild av hur ett instrument för kapillärelektrofores kan vara uppbyggt.
Bild: © Svante Åberg

De olika molekylerna i provet separeras och analys av banden sker oftast redan i kapillären när de passerar en detektor. Detektorn registrerar ofta bandets absorbans men andra typer av detektion är också möjlig, fluorescens, refraktionsindex m.fl. Det förekommer också att de separerade proverna från kapillären leds direkt in i en masspektrometer för analys. Det finns ett antal varianter på kapillärelektrofores som alla bygger på tidigare utvecklade tekniker. Några exempel är kapillärzonelektrofores, separationen i kapillärröret sker i en buffertlösning och kapillärgelelektrofores, röret är fyllt med en gel.

Fördelarna med kapillärelektrofores är att upplösningen är mycket hög. Molekyler med liknande egenskaper kommer ut som separata band och tekniken kan anpassas för många olika ämnen. Man behöver mycket små provvolymer och analysen går fort.

Färgämnen

Patentblått E131 och kinolingult E104 är två livsmedelsfärger som ingår i grön hushållsfärg (1,3,4). Färgämnena patentblått innehåller en och kinolingult två Na+ som avges när ämnet löser sig. Kinolingult får nettoladdningen -2 och patentblått -1. Båda rör sig därför mot anoden, men kinolingult rör sig snabbare med två negativa laddningar. Kinolingult är dessutom något mindre i storlek och rör sig därför också fortare i det täta nätverk som en stärkelsegel bildar.

Figur 9 a) Patentblått E 131, b) Kinolingult E104.
Bild: © Svante Åberg

Färgämnena patentblått innehåller en och kinolingult två Na+ som avges när ämnet löser sig. Kinolingult får nettoladdningen -2 och patentblått -1. Bägge rör sig därför mot anoden, men kinolingult rör sig snabbare med två negativa laddningar. Kinolingult är därtill något mindre i storlek och rör sig därför också fortare i det täta nätverk som en stärkelsegel bildar.

Fördjupning

Litteratur

  1. Informationsbrev 34 - Maj 2005, Kemilärarnas Resurscentrum (KRC)
    http://www.krc.su.se/web/infobrev/filer/34_GyKomGr.doc (2005-06-03)
  2. Christie L. Borgford, Lee R. Summerlin, Chemical Activities, 1988, American Chemical Society, Washington, DC.
  3. Färgämnen i M&M, Jessica Ludvigsson, Skolkemi
    http://school.chem.umu.se/Experiment/137 (2005-12-12)
  4. Livsmedelsverkets hemsida, Livsmedelsverket
    http://www.slv.se/ (2005-12-12)
  5. Andrews A.T., Electrophoresis, 1987, Oxford University Press, New York.
  6. Nationalencyklopedins Internettjänst, Nationalencyklopedin 2005
    http://www.ne.se/ (2005-12-12)
  7. Fernlund P., Fex G., Hanson A., Stenflo J. och Lundh B., Klinisk Kemi i praktisk medicin, 1991, Studentlitteratur, Lund.
  8. Holme D.J. and Peck H., Analytical Biochemistry, 1998, Addison Wesley Longman, New York.
  9. Matthews K and van Holde, Biochemistry, 1990, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Redwood City.
  10. Skolverkets hemsida, Skolverket
    http://www.skolverket.se/ (2005-12-12)
  11. Capillary Electrophoresis, Davidson College, Davidson
    http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/Capillary.html (2006-04-06)
  12. SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), Davidson College, Davidson
    http://www.davidson.edu/academic/biology/courses/Molbio/SDSPAGE/SDSPAGE.html (2006-04-06)
  13. Analytical Chemistry and Instrumentation, Brian M. Tissue, Science Hypermedia
    http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/analytic/ac-meths.htm (2006-04-06)
  14. Category "Electrophoresis", Wikipedia
    http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Electrophoresis (2006-04-06)
  15. Mama Ji's Molecular Kitchen, Arizona State University
    http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/index.html (2006-04-06)
  16. Virtual Lab: Agarose Gel Electrophoresis of Restriction Fragments, Colorado State University
    http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html (2006-04-06)
  17. Agarose gel electrophoresis, University of Western Ontario
    http://www.biochem.uwo.ca/community/molbio/agarose.html (2006-04-06)
  18. Multiphasic Buffer Systems (SDS-PAGE), National Diagnostics
    http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/10 (2006-04-06)
  19. Agarose Gel Electrophoresis with Food Color - Teacher Guide, University of Arizona
    http://biotech.biology.arizona.edu/labs/Electrophoresis_fdclr_teac.html (2006-04-06)
  20. Agarose Gel Electrophoresis with Food Color - Student Handout, University of Arizona
    http://biotech.biology.arizona.edu/labs/Electrophoresis_fdclr_stud.html (2006-04-06)

Fler experiment


elektrokemi, redox
Anodisering och färgning av aluminium
Att göra bly
Citronbatteri
Diffusion av kopparjoner
Elda stålull
Elektrokemisk skrift
Guldpeng av mässing
Gör kopparslanten skinande ren - med redoxkemi
Indikatorpapper för plus och minus på batteriet
Innehåller koksaltet jod?
Kemi med zinkjodid, del 1: Framställning
Kemi med zinkjodid, del 2: Återbilda grundämnena elektrokemiskt
Kemisk klocka med jod
Permanenta håret
Rengöra silver
Rostbildning och rostskydd
Rostindikator visar var järnet rostar
Saltkristaller av en aluminiumburk
Självantändning med glycerol och permanganat
Skämta med en svart kopparslant
Svantes testexperiment
Syrehalten i luft
Tag bort rost med elektrisk ström
Testa C-vitamin i maten
Tillverka tomtebloss
Varför rostar järn och hur kan man förhindra det?
Ärg på en kopparslant

kemiska metoder
Att göra bly
Att vara kemisk detektiv
Bestämning av antalet kristallvatten i kopparsulfat
Blev disken ren?
Bränna papper
Framkalla fingeravtryck med jodånga
Framkalla fotopapper
Framställ låglaktosmjölk
Förtenning
Gör hårt vatten mjukt
Identifiera plasten
Indikatorpärlor
Innehåller koksaltet jod?
Kemi med zinkjodid, del 2: Återbilda grundämnena elektrokemiskt
Kemisk vattenrening
Matoljans viskositet och omättade fettsyror
Mät CMC med hjälp av droppstorleken
Syrehalten i luft
Testa C-vitamin i maten
Tillverka en ytspänningsvåg
Tillverka fotopapper
Tvätta i hårt vatten
Vad innehåller mjölk?
Vattenrening
Visa ytspänning med kanel